Zestaw do szybkiego wykrywania antygenów pełnej krwi, zestaw testowy do domowego antygenu 150-250ul

Z instrumentem medycznym IVD do wykonania zestawu szybkich testów neutralizujących przeciwciała SARS-CoV-2

Zestaw testu fluorescencyjnego przeciwciał neutralizujących i szybki test przeciwciał neutralizujących

Test przeciwciał neutralizujących pseudowirusy przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (5).W skrócie, komórki Vero wysiano na 96-studzienkowych płytkach, aby wytworzyć monowarstwę w momencie infekcji.Wstępnie miareczkowane ilości rVSV-SARS-Cov-2 [phCMV3-SARS-CoV-2 pik SARS-CoV-2-pseduotypu VSV-ΔG-GFP (białko zielonej fluorescencji) wytworzono przez transfekcję komórek HEK293T, ATCC CRL-3216] z seryjnie rozcieńczonym ludzkim osoczem w 37°C przez 1 godzinę przed dodaniem do konfluentnych monowarstw komórek Vero (ATCC CCL-81) w 96-studzienkowych płytkach.Komórki inkubowano przez 12 do 16 godzin w 37°C w 5% CO2.Komórki następnie utrwalono w 4% paraformaldehydzie, wybarwiono 1 μg/ml Hoechst i zobrazowano za pomocą urządzenia do obrazowania CellInsight CX5 w celu ilościowego określenia całkowitej liczby komórek wyrażających GFP.Zakażenie znormalizowano do średniej liczby komórek zakażonych rVSV-SARS-CoV-2 inkubowanych z normalnym ludzkim osoczem.LOD ustalono na <1:20 na podstawie próbek osocza z serii nienaświetlonych osób kontrolnych.Ujemne sygnały zostały ustawione na 1:19.Neutralizacja IC50 (mediana stężenia hamującego) miana obliczono stosując regresję One-Site Fit LogIC50 w GraphPad Prism 8.0.

Wysokowydajny test neutralizacji oparty na fluorescencji

Aby wypełnić lukę w serodiagnostyce COVID-19 i ocenie szczepionek, opracowaliśmy test oparty na fluorescencji, który szybko i niezawodnie mierzy neutralizację reporterowego SARS-CoV-2 przez przeciwciała z próbek pacjentów.Test został zbudowany na stabilnym mNeonGreen (mNG) SARS-CoV-2, gdzie gen mNG został zmodyfikowany w ORF7 genomu wirusa (ryc.1a)10.Pełna sekwencja mNG SARS-CoV-2 jest opisana na dodatkowym rysunku.1.Postać1bprzedstawia schemat blokowy testu neutralizacji reportera w formacie 96-dołkowym.Protokół testu jest szczegółowo opisany w metodach uzupełniających.Pokrótce, surowice pacjentów seryjnie rozcieńczano i inkubowano z wirusem reporterowym.Po inkubacji w 37°C przez 1 godzinę, komórki Vero CC-81 (wstępnie wysiane na 96-studzienkową płytkę) zakażono mieszaniną wirus/surowica przy krotności infekcji (MOI) 0,5.16 godzin po zakażeniu komórki mNG-dodatnie oznaczono ilościowo za pomocą czytnika do obrazowania o dużej zawartości (ryc.1b).Należy zauważyć, że do testu mNG wybrano komórki Vero CC-81, a nie komórki Vero E6, aby umożliwić dokładną ocenę ilościową komórek fluorescencyjnych.Sześćdziesiąt próbek surowicy COVID-19 od pacjentów potwierdzonych RT-PCR i 60 próbek surowicy innych niż COVID-19 (zarchiwizowanych przed pojawieniem się COVID-19) przeanalizowano przy użyciu wirusa reporterowego.W przypadku niektórych próbek z dodatnim wynikiem na COVID-19, dni pobrania próbek po wirusowej reakcji RT-PCR były dostępne i zostały wskazane w tabeli​Tabela 1.1.Po infekcji wirusem reporterowym komórki zmieniły kolor na zielony przy braku surowicy (ryc.1c, panel dolny);przeciwnie, inkubacja wirusa reporterowego z surowicą pacjenta COVID-19 zmniejszyła liczbę komórek fluorescencyjnych (górny panel).Pomiędzy liczbą komórek fluorescencyjnych a krotnością rozcieńczenia surowicy uzyskano krzywą dawka-odpowiedź (ryc.1d i uzupełniający rysunek. 2), co pozwoliło na określenie krotności rozcieńczenia neutralizującego 50% komórek fluorescencyjnych (NT50).Test reporterowy szybko zdiagnozował 120 próbek w ciągu 24 godzin: wszystkie 60 surowic COVID-19 (próbki 1–60) wykazały dodatnie NT50 od 35 do 5711, a wszystkie 60 surowic innych niż COVID-19 (próbki 61–120) wykazywały ujemne NT50 z <20 (Tabela 1).

Parametr: